Nanotoxicologie : analyse des endotoxines

Tests d'endotoxines pour les nanoparticules

Un autre test de contrôle critique consiste à déterminer la concentration d’endotoxines dans les solutions de nanoparticules. Les endotoxines sont des composants des membranes externes des bactéries, le plus souvent des bactéries à Gram négatif, qui sont libérées lorsque les cellules sont perturbées. Lorsque la concentration est élevée, ils peuvent produire une réaction toxique. La contamination par les endotoxines peut provenir des matériaux réactifs utilisés dans la fabrication des nanoparticules ou être introduite lors des étapes ultérieures de fabrication et de traitement. Chez nanoComposix, toutes les formulations de nanoparticules BioPure sont préparées selon des protocoles aseptiques et chaque réactif de départ est testé pour garantir qu'il contient des niveaux d'endotoxines extrêmement faibles. L’utilisation de réactifs de synthèse à faible concentration en endotoxines est essentielle car, en raison de leur plus grande taille, les endotoxines seront concentrées avec les nanoparticules lors de l’étape de concentration par filtration à flux tangentiel.

Les nanoparticules d'argent ont des propriétés optiques inhabituelles en termes de taille, de forme et d'agglomération qui interfèrent avec les tests standards d'endotoxines. Les premières tentatives d’utilisation d’un test d’endotoxines chromogéniques ont échoué en raison des fortes propriétés optiques des nanoparticules d’argent. Le test des endotoxines chromogènes utilise un substrat chromophore synthétique qui devient fortement coloré lorsqu'il est exposé aux endotoxines. L'intensité de la couleur est linéaire par rapport à la concentration en endotoxine sur une large plage, ce qui permet de calculer la concentration en endotoxine par comparaison avec une courbe standard. Bien que ce test soit généralement considéré comme le plus simple des tests d'endotoxines et qu'il soit très sensible, avec une limite inférieure de détection (LLoD) d'environ 0,005 UE/mL, l'intensité de la couleur chromogène est mesurée à 405 nm, ce qui chevauche les pics d'extinction des nanoparticules d'argent ( Figure 1). En raison de la réponse optique importante des solutions de nanoparticules d’argent, le signal colorimétrique supplémentaire du test n’est pas mesuré avec précision et aboutit à des valeurs erronées.

Extinction (the sum of scattering and absorption) spectra of NanoXact silver nanoparticles with diameters ranging from 10 - 100 nm at mass concentrations of 0.02 mg/mL.  BioPure nanoparticles have optical densities that are 50-times larger.

En 2011, nous avons modifié un test développé par le Laboratoire national de caractérisation (NCL) du National Cancer Institute (NCI) qui mesure avec précision les niveaux d'endotoxines en présence de solutions de nanoparticules d'argent à l'aide d'un instrument de test de turbidité cinétique Pyros. Depuis 2012, toutes les solutions BioPure vendues par nanoComposix sont garanties avoir une concentration en endotoxines inférieure à 2,5 EU/mL, un seuil sélectionné en collaboration avec le NCL. Cela correspond à une concentration massique d’endotoxines < 0,3 ng/mL pour une solution de 1 mg/mL de nanoparticules d’argent. Nous pensons que le test de turbidité cinétique est la méthode la plus précise pour mesurer les niveaux d'endotoxines en présence de nanoparticules d'argent. Cependant, certaines modifications importantes doivent être apportées à la procédure standard afin d'obtenir des résultats précis et celles-ci sont discutées ci-dessous.

APERÇU DU ESSAI DE TURBIDITÉ CINÉTIQUE

Le test de turbidité cinétique est basé sur la réaction entre une endotoxine et un lysat. Si une endotoxine est présente, le réactif lysat provoque une réaction de coagulation qui augmente la densité optique de la solution. Un spectromètre mesure la DO à 660 nm, en fonction du temps, et surveille le temps nécessaire pour atteindre 20 mAb (0,2 DO de plus que la référence initiale de l'échantillon lorsque le temps = zéro, Figure 8). Ces données sont comparées à une courbe standard pour calculer quantitativement la concentration en endotoxine.

Figure 3: OD vs. time data collected in a Kinetic Turbidity assay. Le test est très sensible, avec une limite de détection minimale d’environ 0,005 UE/mL, et a été vérifié par le laboratoire de caractérisation des nanotechnologies du NCI et nanoComposix pour fonctionner extrêmement bien avec les formulations de nanoparticules. Deux excellentes ressources pour en savoir plus sur les analyses d’endotoxines pouvant être utilisées pour les nanomatériaux sont disponibles sur le site Web du NCL ainsi que dans cet article de revue.

PROTOCOLE DE TEST DE LA CONCENTRATION D'ENDOTOXINE DANS LES FORMULATIONS DE NANOPARTICULES BIOPURES

Le protocole du test LAL de turbidité cinétique suit essentiellement la procédure décrite dans la méthode NCL STE-1.2 disponible en ligne. Le principal défi de l’adaptation de cette procédure au test des nanoparticules d’argent est la modification des propriétés optiques des nanoparticules d’argent due à la déstabilisation de concentrations élevées de nanoparticules d’argent en présence des réactifs KT. Cela peut entraîner les deux problèmes suivants :   

Problèmes de DO de base : le test détecte la DO à 660 nm. Les formulations de nanoparticules d'argent plus grosses présentent une extinction significative à 660 nm. Si la DO de fond est relativement élevée (par exemple >0,1 ou 0,2), cela peut réduire la plage dynamique du test. Pour les échantillons avec une DO élevée à 660 nm, l’échantillon doit être dilué pour réduire la DO de base, ou le surnageant doit être testé en l’absence de nanoparticules.

Modification des problèmes de référence : ce test collecte généralement des échantillons de données de référence OD pendant les 30 premières secondes. Si le lysat provoque l’agrégation des particules, cela peut augmenter considérablement la DO de base à 660 nm (Figure 2), ce qui peut entraîner une détection faussement positive de l’endotoxine. La solution consiste à réduire la durée de la collecte de référence. Si la réduction de la collecte de base n'est toujours pas suffisante pour obtenir des résultats précis, la concentration de l'échantillon doit être réduite pour réduire l'impact sur la ligne de base.

Figure 2: Spectra of silver nanoparticles in the presence of 0.15 M NaCl. Note the formation of a secondary peak between 600 and 700 nm that is indicative of agglomeration.

Pour éviter les problèmes de référence et de changement de référence, nous recommandons que les matériaux nanoComposix BioPure soient testés en utilisant les dilutions répertoriées dans le tableau 5. Alternativement, une limite de détection plus élevée peut être obtenue en faisant tourner les nanoparticules d'argent et en mesurant la concentration d'endotoxine dans le surnageant. . Lors de tests internes chez nanoComposix, plus de 85 % de la teneur en endotoxines mesurée reste dans la solution par rapport à celle liée à la surface des nanoparticules. Nous proposons également des tests d'endotoxines sur chaque lot de nanoparticules BioPure et fournissons ces informations à nos clients dans les fiches techniques fournies avec chaque commande.

Diamètre des nanoparticules Dilution suggérée des formulations BioPure
10 nm 1:500
20 nm 1:250
30 nm 1:150
40 nm 1:100
50 nm 1:100
60 nm 1:100
80 nm 1:50
100 nm 1:50

Tableau: Dilutions suggérées pour les formulations BioPure à l’aide du test de turbidité cinétique. Les formulations NanoXact peuvent être testées sans dilution.

LIMITES D'ENDOTOXINES POUR LES PRODUITS NANOCOMPOSIX

Chez nanoComposix, nous garantissons que nos formulations concentrées Biopure ont un niveau d'endotoxines mesuré inférieur à 2,5 EU/mL pour les particules de taille > 20 nm et inférieur à 5 EU/mL pour les particules de 20 nm et moins. Lorsqu'ils sont dilués à des concentrations de travail standard (telles que 0,02 mg/mL NanoXact), les niveaux d'endotoxines sont proches de la limite de détection dans notre système de test et sont considérés comme « sans endotoxines ». Si vous avez des questions sur nos mesures d'endotoxines ou si vous souhaitez plus d'informations sur la valeur d'endotoxines mesurée pour un lot spécifique, veuillez nous contacter.

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